背景介紹

     促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin,EPO)是一種糖蛋白，絕大部分由腎臟產(chǎn)生，主要功能是促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，提高機(jī)體血紅蛋白的濃度，臨床上主要用于治療腎性貧血和腫瘤等各種慢性疾病所伴發(fā)的貧血。近年來研究發(fā)現(xiàn)，EPOR還廣泛表達(dá)于人體內(nèi)的非造血組織，它們與EPO結(jié)合發(fā)揮器官保護(hù)、免疫調(diào)理、抗炎等多種非造血作用，所以EPO被認(rèn)為是一種多效性作用的細(xì)胞因子。EPO是迄今所知作用單一且安全可靠的升血紅蛋白制劑。EPO的應(yīng)用能有效改善腎性貧血患者生活質(zhì)量，減少輸血次數(shù)，甚至不輸血，降低心血管等并發(fā)癥的發(fā)生率。

EPO分子骨架為165個氨基酸組成的肽鏈，具有3個N端連接的糖基化位點(diǎn)和1個O端連接的糖基化位點(diǎn)，糖鏈占蛋白總分子質(zhì)量的40％，是一種高度糖基化的蛋白。唾液酸分布于糖鏈末端，作為EPO的主要活性成分之一，唾液酸含量的多少對EPO體內(nèi)生物學(xué)活性的高低起決定性作用。EPO蛋白唾液酸化修飾程度的差異會導(dǎo)致所帶電荷的差異，EPO蛋白不同唾液酸化修飾組分的分析檢測也就是對其不同電荷異質(zhì)體組分的分析檢測。

 傳統(tǒng)電荷異質(zhì)體的分析手段主要依靠平板等電聚焦電泳(IEF)，通過等電點(diǎn)差異對電荷異質(zhì)體進(jìn)行分離，唾液酸化程度較高的組分相對等電點(diǎn)較低。然而這種方法只能對不同組分進(jìn)行定性分析，難以對各個組分的相對百分含量進(jìn)行分析，使用范圍十分局限。隨著蛋白分析手段的不斷進(jìn)步和發(fā)展，基于毛細(xì)管電泳分析技術(shù)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)以其快速、高效、準(zhǔn)確的分析特點(diǎn)逐步被應(yīng)用于蛋白的電荷異質(zhì)體分析。

本方法主要采用CAPEL-205高效毛細(xì)管電泳儀，基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)檢測技術(shù)進(jìn)行EPO蛋白不同唾液酸化程度的電荷異質(zhì)體的檢測，參照的是歐洲藥典1316(Identification, method B. Capillary zone electrophoresis) 中的方法。

測試條件

BGE：按照歐洲藥典1316的條件

毛細(xì)管電泳:      L_eff/ L_tot = 102/112 cm，ID= 50 µm

樣品進(jìn)樣:         1000 mbar ，5s

電壓:               +16 kV

溫度:               35℃

 檢測波長:         214nm

 樣品: 用于物理化學(xué)測試的促紅細(xì)胞生成素的電荷異質(zhì)體

           CRS 1-8-EPO

圖1 檢測色譜圖

結(jié)論

       采用CAPEL-205高效毛細(xì)管電泳儀，基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)檢測技術(shù)進(jìn)行EPO蛋白不同唾液酸化程度的電荷異質(zhì)體的檢測，可以實(shí)現(xiàn)EPD電荷異質(zhì)體的有效分離，方法準(zhǔn)確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可以滿足藥品實(shí)驗(yàn)室日常分析及研究要求。

配置列表

Capel-205毛細(xì)管電泳儀的優(yōu)勢特點(diǎn)

• 通過施加高壓電場，基于毛細(xì)管液體樣本組成成分遷移速度的差別。應(yīng)用UV吸收檢測技術(shù)，在毛細(xì)管出口應(yīng)用高精度光學(xué)系統(tǒng)定量檢測分離出的組分 

• 光源：高強(qiáng)度氘燈，優(yōu)化光學(xué)設(shè)計(jì)保證低檢出限 

• 可實(shí)現(xiàn)多種不同分析方法和分離模式，毛細(xì)管區(qū)帶電泳，毛細(xì)管膠束電動色譜，毛細(xì)管等電聚集，毛細(xì)管凝膠電泳，毛細(xì)管等速電泳 

• 全自動進(jìn)樣，進(jìn)樣方式可選電動及壓力進(jìn)樣。壓力進(jìn)樣，步進(jìn)值1mbar，*高99mbar；電動進(jìn)樣，電壓范圍：步進(jìn)值1kV，1-25kV可調(diào)

• 毛細(xì)管冷卻：恒溫水冷系統(tǒng)，環(huán)境溫度5-50℃可調(diào)；恒溫水冷保證溫度控制更加精細(xì)和準(zhǔn)確，提高分析效果（相對與風(fēng)冷，冷卻效果更優(yōu)/與液冷相比，成本更低） 

• 標(biāo)準(zhǔn)離心管1.5mL(Eppendorf型)適用于所有樣本分析 

• 擴(kuò)展的全自動進(jìn)樣器，高達(dá)59個進(jìn)樣位，允許提供自動過夜分析功能 

• *全自動開口進(jìn)樣設(shè)計(jì)，避免揮發(fā)和交叉污染 

• 新型高壓模塊提供±30kV壓力，保證超優(yōu)的分析效率和快速分析時間 

• 采用流動電位控制技術(shù)，極大提高重現(xiàn)性，尤其是分析復(fù)雜樣品更具優(yōu)勢