PCR是1984年開始出現(xiàn)的一項(xiàng)基因檢測技術(shù)，由于PCR技術(shù)具有簡便易行、敏感度高等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床檢測，成為分子生物學(xué)必要的研究工具。傳統(tǒng)的PCR定量是應(yīng)用終點(diǎn)PCR來對樣品中的模板量進(jìn)行定量，通常用凝膠電泳分離，并用熒光染色來檢測PCR反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物。但在PCR反應(yīng)中，由于反應(yīng)體系和反應(yīng)條件等因素會影響PCR反應(yīng)效率，甚至出現(xiàn)一些非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。因此，用終點(diǎn)PCR法來定量并不準(zhǔn)確。
熒光定量PCR是1996年推出的一種新的定量技術(shù)，該技術(shù)克服了PCR法進(jìn)入平臺期后定量的較大誤差問題，實(shí)現(xiàn)DNA/RNA的定量，而且具有敏感度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、實(shí)時和準(zhǔn)確等特點(diǎn)，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)及臨床醫(yī)學(xué)研究方面都有著重要的意義。
熒光定量是通過殺滅熒光源，使試劑發(fā)出熒光，從而誘導(dǎo)對應(yīng)的dna的復(fù)制，從而檢測到dna的結(jié)構(gòu)變化，他的熒光源一般是react熒光抗體，目前在熒光定量的實(shí)驗(yàn)中使用react檢測基因序列的變化。可以用來檢測轉(zhuǎn)錄組、信號通路組、外顯子組的轉(zhuǎn)錄或翻譯能力的變化等，這些轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)以及信號通路的數(shù)據(jù)將決定在熒光實(shí)驗(yàn)方面的分析結(jié)果，特別是基因組dna的反轉(zhuǎn)錄活動，在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中具有一定的重要意義。
熒光定量PCR操作的關(guān)鍵在于RNA的抽提和引物的設(shè)計。RNA的抽提需要嚴(yán)格進(jìn)行RNasefree的操作，抽提的RNAOD260/OD280需嚴(yán)格控制在1.9-2.1之間。引物設(shè)計主要的考慮是其PCR反應(yīng)特異性好和擴(kuò)增效率高，進(jìn)行PCR反應(yīng)時無非特異性的條帶和引物聚合體出現(xiàn)，盡量選取GC含量在40-60%的區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增。另外，還需要適應(yīng)熒光定量PCR儀上機(jī)條件的設(shè)定，退火溫度在55-65°C之間。除此之外，其他各個環(huán)節(jié)如試劑的穩(wěn)定性，RNA反轉(zhuǎn)的質(zhì)量好壞，PCR上機(jī)條件的設(shè)定，加樣的手法和熟練度等等也要注意。
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